Nat Commun｜化膿鏈球菌通過 PDH 調(diào)控乙酰 CoA 重塑宿主疾病耐受機制

一、 研究背景

化膿性鏈球菌可引發(fā)輕重差異極大的各類感染，全球每年超50萬人死于重癥感染，感染損傷異質(zhì)性機制尚不清晰。區(qū)別于清除病原體的免疫抵抗，疾病耐受性通過減輕免疫病理損傷保護組織；該菌有氧發(fā)酵關(guān)鍵酶丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（PDH）可獨立調(diào)控組織損傷，其代謝生成的乙酸、甲酸等短鏈脂肪酸能調(diào)控免疫，但完整作用通路尚不明確。

已有研究發(fā)現(xiàn)PDH可抑制抗炎修復(fù)因子IL-10、加重皮膚潰瘍，但其代謝產(chǎn)物調(diào)控巨噬細胞IL-10的胞內(nèi)代謝及表觀機制、靶向PDH緩解組織損傷的療效仍缺乏系統(tǒng)驗證。依托特異性原核PDH小分子抑制劑，該篇文章借助小鼠壞死性皮膚感染模型，闡明發(fā)酵產(chǎn)物通過乙酰輔meiA及蛋白乙酰化重塑巨噬細胞免疫的分子機制，驗證PDH抑制劑減輕感染組織損傷的應(yīng)用潛力。

二、 研究結(jié)果

1、 PDH對促進潰瘍進展和晚期感染是必需

研究人員在皮下感染模型中發(fā)現(xiàn)，野生型（WT）菌株所致潰瘍持續(xù)擴大至第6天，而ΔPdh菌株的潰瘍在感染后1天即停止進展，面積顯著小于WT。盡管兩菌株在感染后3天的組織載菌量無差異，ΔPdh從第6天開始以更快速度被清除。提示PDH對于潰瘍進展和晚期感染的維持至關(guān)重要，且其作用獨立于細菌在組織中的生長能力。

2、 ARMAF 改變了細胞免疫應(yīng)答的組成

研究人員通過化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)，感染后1h發(fā)現(xiàn)WT菌招募了更多的活性氧（ROS）產(chǎn)生細胞，該效應(yīng)主要來自中性粒細胞（抗Gr1抗體可消除）。感染后3天的流式細胞分析表明，ΔPdh感染組織中巨噬細胞數(shù)量約為WT的5倍，中性粒細胞約1.5倍。單細胞RNA測序進一步鑒定了15個免疫細胞亞群，ΔPdh感染導(dǎo)致巨噬細胞、中性粒細胞比例升高，并引起B(yǎng)細胞和T細胞內(nèi)干擾素及細胞因子信號通路的差異表達。以上數(shù)據(jù)表明，有氧混合酸發(fā)酵（ARMAF）通過PDH重塑了感染局部的細胞免疫應(yīng)答組成。

3、 PDH有助于細胞外生長以及依賴免疫細胞的細菌清除

研究人員通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)，WT鏈球菌主要呈胞外聚集，被中性粒細胞包圍；ΔPdh鏈球菌則大量存在于巨噬細胞和中性粒細胞內(nèi)部。透射電鏡發(fā)現(xiàn)ΔPdh感染的巨噬細胞中含更多胞內(nèi)細菌且細胞核損傷較輕。巨噬細胞清除實驗（氯膦酸鹽脂質(zhì)體）導(dǎo)致WT感染小鼠死亡率達70%且細菌載量升高，而ΔPdh感染小鼠僅10%死亡；中性粒細胞清除（抗Gr?1抗體）則加重WT所致組織損傷但ΔPdh不受影響。這些結(jié)果表明，PDH幫助細菌維持胞外生活方式并逃避巨噬細胞和中性粒細胞介導(dǎo)的清除，而巨噬細胞主要控制載量，中性粒細胞主要限制損傷。

4、 ARMAF 會抑制抗炎和傷口愈合反應(yīng)

研究人員利用10BiT（g IL-10細菌人工染色體（BAC）轉(zhuǎn)基因） IL10報告小鼠，ΔPdh感染組織中表達Thy1.1（IL10替代標志）的巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞比例及平均熒光強度均高于WT，而T細胞無差異。scRNAseq顯示ΔPdh感染的中性粒細胞中IL10信號通路上調(diào)，巨噬細胞偏向M2表型（高表達Tgm2、Vegfa等修復(fù)相關(guān)基因），WT則偏向M1表型（高表達IL1β、CCL3）。免疫熒光證實ΔPdh感染的巨噬細胞高表達M2標志物CD163和CCL22。因此，研究結(jié)果提示ARMAF通過PDH抑制了髓系細胞來源的IL10表達和傷口愈合程序。

5、 ARMAF產(chǎn)生的短鏈脂肪酸通過改變宿主乙酰輔meiA的水平來調(diào)節(jié)IL-10的表達

研究人員發(fā)現(xiàn)，WT菌感染巨噬細胞后上清中乙酸和甲酸濃度顯著高于ΔPdh。向ΔPdh感染體系外源補充乙酸（1 mM）和甲酸（50 µM）可恢復(fù)細菌胞內(nèi)持久性并使IL?10降至WT水平。同時，ΔPdh感染的巨噬細胞中乙酰輔meiA水平顯著低于WT，補充乙酸/甲酸后可上調(diào)乙酰輔meiA。多種GPCR及腺苷受體拮抗劑不影響上述現(xiàn)象，提示作用依賴于代謝而非受體信號。進一步實驗顯示，廣譜HDAC抑制劑曲古抑菌素Awan全抑制WT和ΔPdh感染誘導(dǎo)的IL?10表達，且對細菌存活無影響。分別抑制Class I、IIa、IIb HDAC無效，三者聯(lián)用才可重現(xiàn)TSA效果。RNA?seq顯示TSA對WT感染巨噬細胞的轉(zhuǎn)錄組影響很小，但對ΔPdh感染細胞引起大量基因差異表達，說明WT感染已使乙酰化處于較高水平，抑制去乙酰化可進一步增強乙酰化從而wan全阻斷IL?10。綜上，研究結(jié)果提示PDH來源的乙酸經(jīng)宿主代謝提升乙酰輔meiA，通過增加蛋白乙酰化（靶點非組蛋白）抑制IL?10，而抑制HDAC可放大該效應(yīng)。

6、 利用PDH抑制劑H8重新調(diào)節(jié)碳流可減輕組織損傷

研究人員從20個細菌PDH選擇性抑制劑中篩選出化合物H8，其在有氧條件下有效抑制WT菌生長。體外巨噬細胞感染實驗中，H8處理使WT菌的胞內(nèi)存活率下降、IL?10水平升高至與ΔPdh相似。體內(nèi)實驗中，WT感染小鼠從感染即刻開始在病灶局部每日注射H8（40 mg/kg），3天后潰瘍面積顯著小于未治療組，而細菌載量無差異；ΔPdh感染小鼠加用H8無額外效果。表明通過化學(xué)抑制PDH重編程碳流，可在不減少細菌負荷的條件下減輕組織損傷，驗證了PDH作為治療靶點的可行性。

三、 研究結(jié)論

該篇研究發(fā)現(xiàn)，化膿性鏈球菌通過其有氧混合酸發(fā)酵途徑中的PDH酶，產(chǎn)生乙酸和甲酸，進入宿主巨噬細胞后提升乙酰輔meiA水平，增強蛋白乙酰化，從而抑制抗炎因子IL-10的表達，導(dǎo)致低IL-10/高TNFα的失衡，延緩傷口愈合，加重組織損傷。當PDH活性缺失或被藥物抑制時，乙酸和甲酸產(chǎn)量下降，IL-10表達上調(diào)，招募更多免疫細胞，啟動傷口愈合，減輕組織損傷。因此，使用細菌特異性PDH小分子抑制劑H8重新編程細菌碳代謝，可在不干擾細菌清除的前提下，有效減輕感染引起的組織損傷。